Spermatogenese in de testis van een muis aangevuld met een DNA-fluorescentie kleuring met DAPI.
Het doel van dit preparaat is om zoveel mogelijk details van spermatogenese te laten zien en om fluorescerende DNA-kleuring in DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)[4] te maken en te laten zien.
De testis van een muis werd gefixeerd met een 4% formaldehyde oplossing en na dehydratie ingebed in Technovit 7100. Coupes werden gesneden op een LKB 2218 Historange rotatiemicrotoom. De coupedikte is 1µm.
Coupes werden op een objectglas gestrekt in gekookt AD-water en daarna gedroogd op 80° C. Daarna verbleven de objectglaasjes 48 uur in isopropanol 100%. Deze stap werd gemaakt om alle verontreinigingen uit het Technovit volledig van het objectglas te verwijderen.
Naast het Technovit is ook een deel ingebed in LR-White en gesneden op een Reichert-Jung ultramicrotoom. Deze coupes werden gesneden met een Diatome diamantmes en gestrekt op water.
De coupedikte was hier 0,8µm.
Na het kleuren en indekken worden er foto's gemaakt op de Leitz Orthoplan met een Moticam 2300 camera.
Naast het Technovit is ook een deel ingebed in LR-White en gesneden op een Reichert-Jung ultramicrotoom. Deze coupes werden gesneden met een Diatome diamantmes en gestrekt op water.
De coupedikte was hier 0,8µm.
Na het kleuren en indekken worden er foto's gemaakt op de Leitz Orthoplan met een Moticam 2300 camera.
Afbeelding van www.Pathbase.net [1]
Spermatogenese[2]
De cellen van de spermatogenetische reeks vormen vier tot acht lagen tussen de basale membraan en het lumen van de tubuli seminiferi. In deze ontwikkelingsreeks, die als geheel met de term spermatogenese wordt aangeduid, zijn de volgende stadia te onderscheiden:
1 de spermatocytogenese, waarbij spermatogonia zich delen en steeds nieuwe generaties van spermatocyten produceren;
2 de meiose, waarin de primaire spermatocyt een tweetal delingen doormaakt, waarbij het aantal chromosomen per cel, alsook de hoeveelheid DNA per cel worden gehalveerd, waarbij spermatiden ontstaan;
3 de spermiogenese, waarin de spermatiden via een differentiatieproces overgaan in spermatozoën of spermiën.
Afbeelding uit Sobotta [3]
Cellen van Sertoli[2]
De cellen van Sertoli of voedstercellen hebben een langgerekte piramide- tot trapeziumvorm en zijn met hun brede basis gelegen tegen de basale membraan[4]; hun apicale einde reikt tot in het lumen[4] van het zaadbuisje. Hun cytoplasma is overigens lichtmicroscopisch niet waarneembaar.De cellen van de spermatogenetische reeks zijn gelegen in de intercellulaire ruimte tussen de Sertolicellen, waarbij deze diep in het cytoplasma[4] kunnen doordringen.
Functies van Sertoli cellen[2]
Behalve het instandhouden van de bloed-testis barrière, hebben de Sertoli cellen nog de volgende functies.
1 Steun, bescherming en voeding van de zich ontwikkelende zaadcellen. De spermatogenetische cellen liggen ingebed in het cytoplasma van Sertoli cellen.
2 Afbraak van restlichaampjes. Gedurende de spermiogenese worden cytoplasmadelen van zich differentiërende spermatiden geëndocyteerd (= opgenomen) door Sertoli cellen en in hun lysosomaal apparaat verteerd.
3 Secretie. De cellen van Sertoli scheiden een vocht naar het tubuluslumen af dat een rol speelt bij het transport van de vrijkomende zaadcellen.
1 Steun, bescherming en voeding van de zich ontwikkelende zaadcellen. De spermatogenetische cellen liggen ingebed in het cytoplasma van Sertoli cellen.
2 Afbraak van restlichaampjes. Gedurende de spermiogenese worden cytoplasmadelen van zich differentiërende spermatiden geëndocyteerd (= opgenomen) door Sertoli cellen en in hun lysosomaal apparaat verteerd.
3 Secretie. De cellen van Sertoli scheiden een vocht naar het tubuluslumen af dat een rol speelt bij het transport van de vrijkomende zaadcellen.
De cellen van Sertoli van de mens en van vele dieren vermenigvuldigen zich tijdens de reproductieve periode niet. Zij zijn buitengewoon resistent tegen allerlei schadelijke invloeden zoals infectie, ondervoeding, röntgenstralen en overleven zulke invloeden veel beter dan de cellen van de spermatogenetische reeks.
Afbeelding uit Sobotta [3]
Het interstitium tussen de tubuli seminiferi[2]
De ruimte tussen de tubuli seminiferi is gevuld met losmazig bindweefsel met daarin zenuwweefsel, bloed- en lymfevaten. De capillairen[4] in de testis zijn van het gefenestreerde (= kleine gaatjes) type.
In het bindweefsel liggen de interstitiële cellen of cellen van Leydig, alsook fibroblasten[4], mestcellen[4] en macrofagen[4].
Interstitiële cellen van Leydig[2]
Dit zijn ronde tot veelhoekige cellen met een eosinofiel cytoplasma, waarin veel kleine lipidedruppels[4] voorkomen. Deze cellen hebben de typische kenmerken van steroïdproducerende cellen met een sterk ontwikkeld glad ER en tubulaire cristae in de mitochondriën.
Het steroïdhormoon dat deze cellen produceren is het testosteron, dat verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van de mannelijke secundaire geslachtskenmerken, alsook noodzakelijk is voor de spermatogenese.
Dit zijn ronde tot veelhoekige cellen met een eosinofiel cytoplasma, waarin veel kleine lipidedruppels[4] voorkomen. Deze cellen hebben de typische kenmerken van steroïdproducerende cellen met een sterk ontwikkeld glad ER en tubulaire cristae in de mitochondriën.
Het steroïdhormoon dat deze cellen produceren is het testosteron, dat verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van de mannelijke secundaire geslachtskenmerken, alsook noodzakelijk is voor de spermatogenese.
Tijdlijn spermatogenese[5],[6]
Het hele differentiëringsproces van spermatogonium tot rijpe spermatide duurt bij de muis ongeveer 35 dagen[5], en bij de mens ongeveer 75 dagen[6].
Het hele differentiëringsproces van spermatogonium tot rijpe spermatide duurt bij de muis ongeveer 35 dagen[5], en bij de mens ongeveer 75 dagen[6].
Aanmaak van DAPI en kleurprotocol
De fluorescerende kleurstof DAPI (4′,6-diamidine-2-fenylindool)(CAS: 28718-90-3) kleurt specifiek DNA.
De safety data sheet van Sigma-Aldrich kan hier gedownload worden.
Technovit 7100 laat zich verassend goed met DAPI aankleuren, LR-White kleurt niet. DAPI wordt aangeboden in zeer lage concentraties.
| Aanmaak van DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | ||
| 1 microgram DAPI oplossen in 1 milliliter AD | ||
| 1 ml DAPI verdelen in 20 Eppendorfer met elk 50 microliter | ||
| Eppendorfer in aluminiumfolie (voorkom licht) verpakken en invriezen. | ||
| Kleurprotocol van DAPI | ||
| 1 Eppendorfer ontdooien op kamertemperatuur | ||
| Los de 50 microliter DAPI op in 50 milliliter Sorensenbuffer van pH 7,4, dus licht alkalisch | ||
| Paar druppels op objectglas aanbrengen | ||
| Laat ongeveer 5 min kleuren | ||
Kort spoelen met AD | ||
| Op warmteplaat drogen en indekken met Depex. |
Coupes snijden op een Diatome diamant mes
Hier worden coupes van een LR-White blok gesneden op een Diatome diamant mes. De coupes worden rechtreeks van het mes gevloeid in gedestilleerd water en kunnen alvast voorstrekken. Na opname met een glasbolletje worden coupes in een waterdruppel op een objectglas gedraaid en kunnen dan op een warmteplaat op 80°C verder strekken en drogen.
Beoordelen van buisstrucuren in een microscopische coupe
Wanneer een buis in een ruimtelijke (3D) omgeving wordt gesneden op een microtoom zal het resultaat van de coupe bijna nooit mooie ronde vormen, maar allerlei verschillende vormen laten zien. De hele testis is een kluwen van buisjes dus in het platte vlak van een preparaat zullen er vele verschillende vormen waarneembaar zijn. Zie tekening voor voorbeelden.
Stitch van vele opnamen naast elkaar
In deze coupe zijn, vele opnamen (148 opnamen met een Leitz Plan Fluotar 16x Objectief) naast elkaar, met behulp van 'zoomify' software aan elkaar gezet. In deze opname kun je verschillende delen oproepen en ook inzoomen. Klik op de foto om 'Zoomify' te starten.
.
Bronvermelding:
[1] www.Pathbase.net ,Hoofdstuk 8. Male genital apparatus, http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_4.html#8.
[2] Junqueira L.C. en Carneiro J. (2004, tiende druk), Functionele histologie, Maarssen. Uitgeverij Elsevier. Hoofdstuk 23, pag. 573, 577, 579 en 580 'Het mannelijk genitaal stelsel'.
[3] Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ulrich Welsch, Elsevier GmBH, Urban&Fischer Verlag München, Sobotta Welsch Lehrbuch Histologie (2010, derde druk), Hoofdstuk 13, pag. 405, 408 en 413 'Geschlechtsorgane', ISBN 978-3-437-44431-9.
[5] Cheryl L. Scudamore, A practical guide to the histology of the mouse, ISBN: 978-1-119-94120-0, Pag 100, 6.3.2 Antomy and histology of Reproductive system.
[6] Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ulrich Welsch, Elsevier GmBH, Urban&Fischer Verlag München, Sobotta Welsch Lehrbuch Histologie (2010, derde druk), Hoofdstuk 13, pag. 409 'Männliche Geschlechtsorgane', ISBN 978-3-437-44431-9.
[7] Prof. Dr. med. Max Clara (1974), Atlas der normalen mikroskopischen Anatomie des Menschen, Uitgeverij Urban&Schwarzenberg. pag. 191, 'Organa genitalia masculina'.